Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии

Во всех случаях получение эритропоэтина ограничивается трудностями, связанными с выделением и культивированием клеток, непостоянностью продукции гормона и, в конце концов, низкой концентрацией его в культуральных жидкостях.

Принципно другой подход к получению огромных количеств высоко очищенного эритропоэтина был связан с применением способов генной и клеточной инженерии. Была изготовлена попытка сотворения бактериального Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии продуцента эритропоэтина (Lee-Huang S., 1984). Продуцируемый в Escherichia coli белок узнается антителами против эритропоэтина и имеет молекулярную массу, приблизительно подобающую дегликозилированному эритропоэтину человека. Понятно, что бактериальные клеточки имеют систему гликозилирования, принципно отличающуюся от эукариотической. Потому получить корректно гликозилированный белок в бактериальных клеточках нереально. В случае эритропоэтина получение корректно гликозилированного гликопротеида Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии имеет принципное значение и, как следует, создание продуцента гормонана базе бактериальных клеток является нецелесообразным.

Действенный продуцент на биологическом уровне активного как in vitro, так и in vivo эритропоэтина может быть получен лишь на базе клеток высших животных. Изготовлена попытка получения эритропоэтина человека на базе клеток насекомых (Wojchowski D. et al Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии., 1987). Для экспрессии гена эритропоэтина в этом случае был применен вектор на базе бакуловируса. Секретируемый клеточками насекомых эритропоэтин имеет молекулярную массу намного ниже, чем нативный эритропоэтин человека, другими словами корректного гликозилирования в данной системе также не происходит. Приобретенный в этой работе эритропоэтин проявляет биологическую активность, по последней мере, в тестах Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии in vitro. О био активности и стабильности in vivo рекомбинантного эритропоэтина, продуцируемого клеточками насекомых, в данной работе не сообщается.

В работе Lin F.-K. et al., 1985 в первый раз cообщается о получении размеренно трансфецированных клеток полосы СНО (эпителио-подобные клеточки из яичника китайского хомяка), продуцирующих эритропоэтин человека Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии. В этом случае для трансфекции клеток использовали плазмиду, содержащую ген эритропоэтина человека под контролем промотора поздних генов вируса SV40. Приобретенные постоянные копии секретировали эритропоэтин в концентрации приблизительно 18 ед./мл. Было показано, что рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый клеточками млекопитающих, обладает био активностью как в тестах in vitro, так и в тестах in Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии vivo.

Для получения высоко действенного продуцента эритропоэтина человека в работе Powell J. et al., 1986 использовали систему амплификации встроенных плазмид в трансфецированных клеточках полосы ВНК (клеточки из почки хомяка). Для этого проводили ко-трансфекцию клеток 2-мя плазмидами, одна из которых содержала ген эритропоэтина человека под контролем вирусного промотора, а Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии другая - ген дигидрофолатредуктазы. Амплификация встроенных плазмид достигалась методом культивирования клеток на среде с повсевременно повышающимися концентрациями метотрексата. Приобретенный в данной работе продуцент секретировал до 80 мг/л эритропоэтина человека.

Подобная работа была проведена в СССР в НПЦ мед биотехнологии (Крамерова И.А. и др., 1988 , Крамерова И.А. и др., 1989 , Крамерова Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии И.А. и др., 1989а). Используя олигонуклеотидный зонд, было проведено клонирование гена эритропоэтина человека, сделаны действенные векторы экспрессии, получены высоко продуктивные клеточные полосы, секретирующие рекомбинантынй эритропоэтин человека, и разработаны способы выделения гормона из культуральной воды клеток-продуцентов. Приобретенный продукт прошел удачные предклинические тесты и подготовлен для тесты в Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии поликлинике.

Исследование устройств взаимодействия эритропоэтина с клетками- мишенями длительное время было нереально из-за отсутствия радиоактивно меченого эритропоэтина, сохраняющего биологическую активность ( Goldwasser E., 1981 ). Эта неувязка было решена благодаря получению рекомбинантного эритропоэтина. Меченый эритропоэтин получают несколькими методами:

1) мечение тритием по углеродной части ( Krantz S., Goldwasser E., 1984 );

2) иодирование ( Sawyer S. et al., 1987 , Todokoro Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии K. et al., 1987 );

3) включение меченных радиоактивной сероватой аминокислот в процессе биосинтеза рекомбинантного эритропоэтина в трансфецированных клеточках ( Mufson P., Gesner T., 1987


epilog-k-rasskazu-monastirskogo-kapellana.html
epilog-napisannij-v-1926-godu.html
epilog-odno-zveno-za-drugim.html